Gruplar Western Blot'ta görünmüyorsa sorun ne olabilir?

Cevap:

Birçok …

Açıklama:

Bantların batıdaki leke üzerinde görünmemesinin birçok nedeni vardır. Örnek ve antikor kombinasyonları geçmişte çalıştı mı?

Aşağıda, grupların görünmemesine neden olabilecek şu anda aklıma gelen bazı şeyler var:

1. Protein jelden transfer oldu mu? Bantların var olup olmadığını görmek için zarı ponceau S veya amido siyahı gibi bir şeyle boyamaya çalışın. Bazen zardaki protein bantlarını ıslatıp ışığa açılı olarak tutarak görebilirsiniz.

2. Birincil antikor çalışıyor mu? Bu, test edilmesi zor bir durumdur ve yapabileceğiniz tek yol, ilgilendiğiniz proteine sahip olduğunuzu bildiğiniz pozitif bir kontrol dahil etmektir. İlgilendiğiniz proteinin bir miktarına sahipseniz, onu Western blot membranına (yani jeli çalıştırmazsınız) tespit etmeye çalışabilir ve membranı western blot sanki işliyorsanız bir sonuç elde edip etmediğinizi görmeyi deneyebilirsiniz.

3. İkincil antikor, birincil antikoru tanıyor mu? Tekrar test etmek zor. Yapabileceğiniz tek test hakkında 2'de yukarıda belirtilen nokta testidir.

4. "Algılama sistemi" çalışıyor mu? Kullanmakta olduğunuz algılama yöntemine bağlı olarak, algılama çözeltisinin ve ayrıca ikincil antikor üzerindeki tetikleyici ajan / enzimin çalışıp çalışmadığını görmek için sekonder antikorun bazılarında spiking yapmayı deneyebilirsiniz. Yani, sadece ikincil antikorla reaksiyonu tetikleyebilir misiniz?

Son olarak, arsanın sonlandırılması sırasında kullanılan arsaların hatalı yapılması kadar basit olabilir. Örneğin, eğer tampondaki tuz konsantrasyonu yanlışsa, bu antikorların lekeden çıkmasına neden olabilir. Aynı şey, tamponların pH'ının yanlış olması durumunda da olur.

Şahsen tecrübe etmediğim çalışmayan bir batı lekesinin en garip nedeni, zarı bloke etmek için kullandığımız süt tozu tedarikçisini değiştirdiğimiz zamandı. Yeni tedarikçiden gelen toz, anti-fosfotirozin antikorumuzla tespit etmeye çalıştığımız tüm fosfat gruplarını çıkartan bir fosfotirozin fosfataz içermiştir.